感谢主办方，感谢巨盛生物，感谢各位同仁，下面很多都是老朋友，大家在一起相聚很不容易。我今天跟大家分享主要是基因细胞领域。刚才郑教授也讲了，在干细胞治疗领域的一些概括。我就具体的参与过的几个项目和大家一起分享一下。
第一张幻灯是我个人的简介，在西班牙读书，回来之后在浙江理工大学工作过一段时间，在法国一直做研究，目前在同济大学担任东方医院的临床医学转化中心免疫细胞治疗临床项目的负责人。因为只有半个小时，我要把幻灯缩短一下。主要介绍：一是基因治疗载体，谈到基因与细胞治疗，离不开就是载体，原理是什么；二是基因治疗目前在国际上应用在哪些方面，主要是联合干细胞做了一些工作。第一是艾滋病，第二个是干细胞。目前用基因载体去修饰干细胞的治疗项目也有。我参加的FP7合作项目，还有CAR-T方面的一些应用；最后重点介绍一下肌母细胞。实际上我们国内忽略了国际上非常熟悉的一类细胞，本来今天罗教授要参加会议，但他目前在加拿大，所以今天我就把罗教授这块的研究跟大家分享一下。
一、基因治疗载体
（PPT图示）这是简单的基因与细胞治疗的原理概括，首先人体的一些疾病跟基因的突变相关，怎么样把基因进行修饰、改造，再对我们人体内产生病变的细胞进行修复之后，回输到体内，补充相关损失掉的功能，这就是基因与细胞联合治疗的新方式。
基因治疗这个方面的载体可以分类，一方面是病毒类的载体，另一方面是非病毒的载体。病毒类的有很多，腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等等。我今天重点讲的是其中一种病毒，叫慢病毒。其来自HIV-1修饰过来的，所以刚才CAR-T治疗白血病就是用了慢病毒载体，那么它的优势在哪里，后面会慢慢介绍。我们中国有第一个基因治疗的药，就是用的腺病毒作为载体表达P53基因。另外还有一类非病毒载体，和病毒性载体相比，它的安全性可以保证。它可以规模化生产，也可以标准化生产，所以它的临床应用也很广泛。
慢病毒载体来源于HIV-1，通过对HIV基因组的修饰，进行改造，科学家做了很多的工作，从94年的第一代慢病毒到目前第四代慢病毒，发展经历了20年。第一代是把HIV-1基因组的相关的、不必要的一些蛋白质，一些调节元件剥离开，做了很多安全性研究，最后构建成我们需要的安全的病毒类载体。为什么临床要用它？是因为它通过了安全性研究，病毒自身的毒性蛋白已经去掉了，只需要的是外源目的基因的功能。
（PPT图示）这个就简单描述一下。因为它是一个RNA病毒，进入细胞之后进行逆转录，逆转录成了CDNA，然后CDNA进行整合，把外源的基因整合到宿主细胞基因组，才把基因通过细胞进行稳定的表达，这是慢病毒的一个优势。
（PPT图示）这是用慢病毒进行表达GFP，做了很多原代细胞的转导，转导之后它的表达率和感染力非常高，持续性表达优越于其他的病毒载体。
（PPT图示）这是绿色荧光蛋白，这是慢病毒做的转基因动物的平台。
（PPT图示）这是我们前期用慢病毒载体转导的一些DC细胞，后面还有T细胞、干细胞等。这里就不赘述了，后面朱泽教授会对T细胞的转染进行阐述。
二、基因治疗在国际上的应用
在艾滋病基因治疗方面的应用，我们中午谈到了和美国（Lentigene）公司。美国（lentigene英文）公司是最早开始慢病毒载体临床实验的公司之一，用第一代慢病毒载体修饰T细胞，CD-4阳性的T细胞，把慢病毒表达了一段反义RNA干扰艾滋病毒的基因组，当时临床很轰动，现在已经进行到临床三期了，就是用了慢病毒载体表达了反义RNA。
通过后期的科学研究发现，有几篇在（nature）杂志上发表，艾滋病不仅感染CD4的阳性T细胞，同时它在病人体内的造血干细胞也有潜伏，所以在CD4阳性T细胞进行修饰之后，不能彻底清除HIV病毒,它本身在造血干细胞有残留。后来就有几个小组做了下列的设计，将病人部分造血干细胞取出，再通过慢病毒载体的修饰，对CCR5受体进行干扰，把受体干扰掉，另外它表达的shRNA，同时干扰病毒载体包装必须的一些结构蛋白，这样的话可以对这个细胞进行保护，因为CCR-5是HIV病毒感染T细胞的一个受体，受体干扰之后，有研究表示它大大降低了病毒感染T细胞的能力。所以，这个研究做了两方面的贡献，一方面保护细胞不被感染，另一方面在保护细胞内持续表达shRNA, 将病毒的基因组进行干扰和破坏。
（PPT图示）在临床治疗方面采取了首先病人的造血干细胞或者在体内获得，在体外通过基因药物载体通过修饰移植体内，这是治疗方案。后续我们和美国的药物在体外进行了一些实验对比，发现我们用刚才设计的载体效果，比现在的单一反义RNA效果好，下面我们在中国会联合疾控和广州八院、中山大学病毒研究所在艾滋病方面推进临床方面的工作。
三、基因治疗载体在干细胞治疗中的应用
下面讲基因治疗载体另外一方面的应用。干细胞在分化过程中怎么把外原基因进行持续的表达，这需要慢病毒载体进行修饰。目前在临床上很少用慢病毒直接修饰干细胞做临床，一个问题就是它的安全性，因为它整合到染色体里，整合的部位在哪里，位点是不是安全，这些都是影响因素。慢病毒载体在干细胞方面，我们怎么用的呢？首先第一步，把慢病毒载体构建成了非整合的慢病毒载体，就解决了刚才的一个安全问题，留下了它高效的转导效率的特性，去掉了它的不安全因素和整合因素。大家知道，中国肝病很多，肝移植很多，但解决方案很少，我们需要制备成熟的肝脏细胞。成熟的肝脏细胞以前是死刑犯或者其他的肝组织里进行提取，然后进行移植。现在我们仅仅做的是研究，我们用的是胚胎干细胞，另外我们的一个小组和剑桥合作做iPS。利用ES与iPS体外进行分化，分化成肝脏祖细胞，但这些细胞并不纯，我们做下来，胚胎干细胞经过16天的分化大概可以获得85%的肝祖细胞（Hepatic progenitors），我们怎么样把这部分细胞进行提纯，如果不提纯的话，用到临床是非常困难的。不纯的，杂的是什么细胞呢？有纤维细胞和神经细胞。有一次，分化完之后，早上我去看细胞，还没有通过显微镜看的时候，我培养细胞培养基有细波纹，当时觉得桌子或仪器在抖，后来就在显微镜一看，发现有部分细胞在跳动，这就是细胞分化过程中产生的肌细胞。所以我们临床不会直接拿来用，必须进行纯化。我做的这个工作就是利用基因载体对细胞进行了纯化。利用肝祖细胞特异启动子表达了绿色荧光蛋白，这样转导细胞之后三天会产生绿光的细胞，就是我需要的细胞，不产生的绿光就不是，所以通过机器把绿色荧光的细胞进行分离（FACS），发现效果非常好，分离出的细胞可以达到我们的需求。关键是细胞可以分离出来后，利用southern进行了检测，载体也没有整合，后续做了一些细胞标志物的检测，这些成果去年刚刚发表在两篇国际杂志上。
四、基因治疗载体在肿瘤免疫细胞中的应用
下面讲一下在肿瘤免疫细胞中的应用，主要讲的是CAR-T，刚才郑教授也讲了，后面还有两位教授会讲CAR-T，我会讲重要的环节在哪里，就是载体的GMP生产和相关靶点的设计。因为CAR-T目前在临床上治疗白血病已经得到非常确切的疗效，那么CAR-T的靶点怎么寻找和构建将会是我们的工作重点。免疫细胞不说了，国家已经颁发了第三类医疗技术手册，如果要做可以通过第三类医疗技术报备的方式。（PPT图示）这有相关的一些文件。
讲一下靶向性免疫细胞治疗。在介绍之前，我介绍一下CTL细胞。目前在国内做的比较是DC-CIK，目前是第二代或者第三代的治疗比较多。第四代靶向的免疫细胞治疗，我们通过DC负载抗原，在体外与T细胞共培养得到了CTL细胞，进行检测和培养，我们不仅用这个技术可以治疗癌症，同时也可以针对病毒的抗原进行一些治疗。我们抗原可以选择，所以现在我们在和309医院肺病研究所针对肺结核、结核杆菌开展合作研究，进行导向性和靶点的选择，另外针对乙肝和其他的疾病都可以通过这个技术进行治疗。
所以一谈到CTL就想到了DC的抗原负载，它有几大类，从刚才讲的病毒类载体表达把抗原基因放到病毒载体里，然后再进行DC细胞的转导与递呈，再和T细胞培养。所以这个过程中载体非常重要，也有直接用肽，也有其他的非整合病毒载体，也有用腺病毒载体。
我们在巴黎的时候做了一项临床实验，是非细胞肺癌，是美国最大的（英文名），直接用裸基因的表达框表达抗原。 CAR-T重要的一个产业化环节是什么地方？就是在基因载体的生产合不合格，直接影响CAR-T的临床应用。我们是06年就拿到了（lentivector）的授权，在中国生产GMP级别的慢病毒载体。我们从06年一直在完善，大规模的生产设备和GMP标准.去年我们看到一些研究，慢病毒在CAR-T方面突破性的进展,很兴奋。目前这个在临床上需求量非常大，所以我们要做好每个生产环节，有朋友若需要使用，我们比昂生物可以提供大规模的GMP级别的慢病毒载体用于CAR-T研究。
朱教授一会儿会和大家详细介绍RNA，因为我们一直在合作，在天津医科大学做mRNA的实验。
五、肌母细胞治疗
什么是肌母细胞，包括我们国家引进肌母细胞下一步要怎么做。肌母细胞是罗教授在美国研究了四十年，后来到加拿大，中国通过外交部和使馆一系列的工作，引进回国。罗教授11年正式回国，罗教授是68岁，唯一破格录取的。
（PPT图示）这是肌母细胞移植研究，包括肌肉萎缩。一个细胞怎么会有如此强大的功能？（PPT图示）这是团队发表的一些文章，包括《柳叶刀》、《科学》、《自然》、《循环》等等，（PPT图示）这是肌母细胞283个原创专利，还有一些已经发展的项目。
目前国际上利用肌母细胞治疗心脏病三期，肌萎缩三期，二型糖尿病是一期，癌症二期。中国医师学会去年开了论证会，这个技术全部引进回国，把肌母细胞作为项目转化。这是13年2月28号的专家论证会。为什么要论证肌母细胞呢？因为我们国家把干细胞已经列为药品管理，作为临床的管理规范，肌母细胞是不是，如果是，该怎么做？如果不是，该怎么做？所以我们一定要通过专家委员会论证，首先论证肌母细胞不是干细胞，它不是最上游的干细胞，所以把它列在第三类细胞移植技术的管理范畴里面，是卫计委这边主管。它只发展成肌肉，首先它对心脏病进行治疗，在美国，还有肌肉萎缩，可以根治营养不良的肌肉萎缩，在二型糖尿病有很大的需求。目前是20个国家一起参与的多中心临床实验，280个肌萎缩和300个心脏病病人，证明该技术非常安全有效的。FDA目前已经批准了19项肌母细胞治疗临床实验，多为二期、三期的心脏病治疗。
肌母细胞是未分化的最原始肌性细胞，能天然融合形成肌管，产生收缩蛋白，令肌细胞再生，增强骨骼肌和心肌收缩功能。心肌营养不良导致心肌细胞坏死，需要新的肌细胞生长。所以首先在人的大腿上提取两克左右的肌肉组织，进行肌母细胞提取，后面会讲到临床上怎么做的。这里有一些幻灯片，因为和俄罗斯政府的一些心脏病专家做的导管移植技术。
（PPT图示）这是整个细胞的提取过程。采取、培养，大规模的扩增。（PPT图示）这个实验室，国家投资了一部分，投资公司投了一部分，在武汉的肌母细胞的GMP生产车间。肌母细胞的临床用量也经过一系列的实验进行了验证，一期、二期、三期，最后是800亿个细胞，在全身82块肌肉注射，参与实验的197个病人，效果非常好。这是罗教授第一次发表的细胞移植的文章，这是目前能查到细胞治疗的历史上最早的一篇文章，90年发表的。第二篇是被誉为美国细胞治疗之父（英文名）发表的，目前美国细胞移植的标准手册是参照罗教授当年的文章所编写的。
（PPT图示）这个图，左边视频显示病人的腿很难自主抬起来，接受治疗后三个月能够自由的自主伸曲（右边的视频）。下面这是国际上第一个在轮椅上4年多经过移植之后站起来的病人。因为心肌萎缩、呼吸功能也都下降，通过对心肌的肌母细胞移植，治疗之后，病人呼吸功能和有效性全部改善。（PPT图示）这是DMD的病人，这些病人到目前还活着，临床上所有医生都知道DMD病人活不长的，这些病人每年会有一次聚会，每次都会邀请罗教授。
（PPT图示）这是三期的实验结果，肌母细胞产生收缩蛋白，另外增加了70%的肌纤维的改善，18个月肌力平均增加了123%，9个月呼吸改善19%，75%的临床实验者病情改善，延长病人的寿命。这是15年期间治疗了280个病人的两年回访，没有死亡和昏迷，没有心脏肾肺的损伤。
（PPT图示）急性心梗的细胞繁殖能力有限，肌母细胞移植再生，有效地增加心肌收缩功能。（PPT图示）这是俄罗斯国家心脏病中心，做的肌母细胞的移植术，通过导管的介入，3D的模型导管注射。
300例的心脏病临床实验的结论，改善左心室射血分数，唤起生存能力，舒展压等等，还有6分钟步行的距离，使心脏再生，这个技术被五个国家允许收费，用肌母细胞治疗一个心脏病人是5万美金，在我们国家目前正在拟进入的有安贞、阜外、武警总医院、海军总医院，上海有瑞金、中山、还有广州几家三甲医院也都在参与肌母细胞治疗心脏病的项目。
（PPT图示）肌萎缩是单基因缺陷，二型糖尿病是GLUT4和IRAP的双基因组缺陷，为什么能够治疗呢？就是因为它是健康供体的肌母细胞，表达正常的基因组表达到细胞上，这样就可以完成增加宿主细胞表达正常蛋白的功能。所以它对二型糖尿病是非常有帮助的。
最后还有两张幻灯，肌母细胞可以杀死肿瘤细胞，第一个是肌母细胞移植到肿瘤组织当中。肌母细胞自己发生融合，融合的时候细胞膜会产生破裂，释放出250倍的TNF-a，这个是在东方医院做的一些动物实验结果，看图。目前在以色列已经做到临床二期了。因为今天幻灯片很多，会后可以做一些详细的了解，我们还有一些临床和临床数据，一会儿朱教授也会和大家分享，有哪些医院可以一块儿合作开展等等。我就讲这么多，谢谢！
